前沿研究
檢測食品中乳酸菌的側(cè)流免疫層析法
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日期：2024.11.07
屬于：前沿研究
乳酸菌(LAB)會導(dǎo)致食品酸化并產(chǎn)生異味成分，Tatsuya Tominaga設(shè)計了一種側(cè)流免疫層析法(LFIA)結(jié)合半導(dǎo)體pH傳感器的方法快速檢測乳酸菌。
抗原抗體結(jié)合具有高特異性，一些抗體（Ab）將特定的細(xì)菌成分作為抗原，因此這些Ab可用于細(xì)菌檢測。在涉及多種細(xì)菌屬的情況下，使用單個Ab檢測LAB非常困難，而以植物乳桿菌為免疫原獲得的抗體能與所有LAB反應(yīng)，以此抗體為基礎(chǔ)進(jìn)行LFIA。然而LFIA檢測結(jié)果中pAb Lpl的光譜太寬，無法將陽性結(jié)果全部歸于LAB，將LFIA法與半導(dǎo)體傳感器結(jié)合，利用半導(dǎo)體傳感器測量pH值，將LAB與其他陽性菌進(jìn)行區(qū)分。LFIA檢測步驟如下，用金屬或乳膠膠體標(biāo)記的抗體(Abs)結(jié)合樣品溶液中的細(xì)菌，細(xì)菌-膠體復(fù)合物通過毛細(xì)管作用在LFIA試紙上遷移，并被另一個預(yù)固定的Ab捕獲。復(fù)合物在該位置積累變成線條或斑點(diǎn)，用于細(xì)菌檢測。
該實(shí)驗評估了使用LFIA結(jié)合半導(dǎo)體pH傳感器進(jìn)特異性檢測LAB可行性。對食品懸浮液進(jìn)行了LAB檢測和pH檢測，通過記錄與比對檢測結(jié)果以及兩項測試均為陽性的培養(yǎng)時間，評估了此方案檢測成功率以及新鮮食品和變質(zhì)食品是否可以以此區(qū)分。此外，利用擴(kuò)增子分析來確定LAB是否在變質(zhì)食品中生長。從酵母中分離三弗朗西斯乳桿菌A1、A2、C1、植物乳桿菌B1和短乳桿菌B2。以F. sanfranciscensis A1和A2為免疫原制備多克隆抗體(pAb) Fsa，以植物乳桿菌B1和短乳桿菌B2為免疫原，分別制備pAb Lpl和pAb Lbr。
乳桿菌屬細(xì)菌的LFIA檢測譜見表1。結(jié)果表明，Lpl-LFIA能夠檢測多種LAB，進(jìn)一步顯示了Lpl-LFIA的適用性。除乳酸菌屬外培養(yǎng)收集到的細(xì)菌檢測譜見表2。
表 1乳桿菌屬細(xì)菌的LFIA檢測光譜
表 2LFIA對乳酸菌屬以外菌株的檢測光譜
一共檢測出12個屬25個種32株的乳酸菌(表1,2)。除LAB外，還檢出革蘭氏陽性菌，包括芽孢桿菌和葡萄球菌。對收集到的菌株進(jìn)行產(chǎn)酸能力測試(表3)。在該測試中，LAB的pH范圍為pH 3.16至pH 4.34，革蘭氏陽性菌的pH范圍為pH 4.49至pH 5.66。說明LFIA陽性和pH < 4.40 (pH陽性)條件下，檢測LAB能力受到了限制。
表 3不同菌株的產(chǎn)酸能力檢測結(jié)果
將購買的食品在≤7℃的冰箱中保存1 d，或從有效期起保存超過一周，制備食品懸浮液。將培養(yǎng)液中細(xì)菌洗滌后與葡萄糖溶液混合，將混合物涂于離子敏感場效應(yīng)晶體管半導(dǎo)體pH傳感器，進(jìn)行產(chǎn)酸能力測試。構(gòu)建用于LFIA的測試條后，將洗滌后的細(xì)菌細(xì)胞連續(xù)稀釋進(jìn)行LFIA檢測。為了計算LAB的數(shù)量，將食物懸浮液加入MRS瓊脂培養(yǎng)基中，表4列舉培養(yǎng)基中形成的菌落，以cfu(菌落形成單位)表示。并從每種食物懸浮液中提取1ml DNA，進(jìn)行PCR、測序和數(shù)據(jù)分析。
表4LFIA的敏感性及產(chǎn)酸能力試驗。
使用4株乳酸菌、3株芽孢桿菌和1株葡萄球菌進(jìn)行敏感性試驗(表4)。對于乳酸菌，至少存在4 - 5 log10 (cfu)細(xì)菌時，LFIA呈陽性，當(dāng)至少存在6-7 log10 (cfu)細(xì)菌時，產(chǎn)酸能力試驗呈陽性。芽孢桿菌和葡萄球菌LFIA≥5-6 log10 (cfu/test)呈陽性，未見pH陽性菌株。當(dāng)樣品中存在≥6-7 log10 (cfu) LAB時，檢測結(jié)果為LFIA陽性和pH陽性。結(jié)果表明，LFIA比產(chǎn)酸比力試驗更敏感。該實(shí)驗分別記錄了新鮮和變質(zhì)食物的培養(yǎng)物L(fēng)IFA陽性和pH陽性的所需時間(表5)，結(jié)果表明，LFIA與pH檢測相結(jié)合可以檢測食品的腐敗程度。
表 5食品樣品LFIA及產(chǎn)酸能力試驗結(jié)果
利用擴(kuò)增子分析對28種LAB數(shù)量增加的食品進(jìn)行了微生物群調(diào)查(表6)。
利用擴(kuò)增子分析對28種LAB數(shù)量增加的食品進(jìn)行了微生物群調(diào)查(表6)。表 6食物中的微生物群
從敏感性試驗中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)樣品溶液中LAB濃度> 6-7 log10 (cfu)時，LFIA和pH試驗均呈陽性。新鮮食品不太可能被這種水平的LAB污染，因此我們對食物懸浮液進(jìn)行多次培養(yǎng)，評估食物腐壞時是否出現(xiàn)LIFA陽性和pH陽性結(jié)果，驗證是否可以區(qū)分新鮮和腐壞的食物。在這些食物中，無法確定三種(胡蘿卜，卷心菜，火腿)是否變質(zhì)。胡蘿卜樣品中并沒有LAB污染。由于新鮮和變質(zhì)樣品顯示陽性的培養(yǎng)時間相同，因此無法檢測到白菜的變質(zhì)狀態(tài)。卷心菜含有蘿卜硫素具有抗菌特性，抑制乳酸菌的生長。火腿沒有檢測到腐敗的原因可能是因為培養(yǎng)時間太短。
該研究成功建立了一套能在1h內(nèi)檢測出食品中乳酸菌的檢測系統(tǒng),以植物乳桿菌B1作為免疫原，獲得了能夠檢測包括LAB在內(nèi)的多種革蘭氏陽性菌的Ab，利用這種Ab進(jìn)行側(cè)流免疫層析法能夠檢測大多數(shù)LAB。
原始出處：Tatsuya Tominaga. Rapid detection of lactic acid bacteria by lateral flow immunochromatographic assay. Journal of Microbiological Methods ,2023，209:16730.
